第1章发酵工程\n第2节　微生物的培养技术及应用\n课标要求核心素养1．了解有关培养基的基础知识。(科学思维)2．掌握培养基的配制、无菌技术及微生物的纯培养。(科学思维、科学探究)3．利用选择培养基分离细菌，运用相应技术解决生产生活中有关微生物的计数。(科学探究)4．关注有害生物的控制、宣传健康的生活方式等。(社会责任)1．概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求，进行酵母菌的纯培养。2．学会区分灭菌和消毒，能进行无菌技术操作。3．阐明微生物选择培养的原理。4．学会利用稀释涂布平板法进行微生物的选择培养。5．进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。\n知识导图\n一　微生物的基本培养技术\n学霸记忆•素养积累训练巩固•课堂达标新知预习•双基夯实课内探究•名师点睛指点迷津•拨云见日\n新知预习•双基夯实\n营养物质生长繁殖凝固剂琼脂\n3．培养基的营养组成各种培养基一般都含有____、______、______和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对____、特殊营养物质以及_____的需求。水碳源氮源pHO2\n二、无菌技术1．获得纯净的微生物培养物的关键：防止__________。2．消毒和灭菌杂菌污染消毒灭菌概念使用较为______的物理、化学或生物等方法杀死物体______或内部一部分微生物使用______的理化方法杀死物体内外______的微生物，包括____________。常用方法______消毒法、巴氏消毒法、______消毒法、紫外线消毒法______灭菌、干热灭菌、______灭菌适用对象操作空间、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等温和表面强烈所有芽孢和孢子煮沸酒精湿热灼烧\n3．具体操作(1)对实验操作的______、操作者的衣着和手进行清洁和______。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行______。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在____________附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与____________接触。空间消毒灭菌酒精灯火焰周围的物品\n三、微生物的纯培养1．纯培养：在微生物学中，将接种于________内，在合适条件下形成的含________________的群体称为培养物。由______________所获得的微生物群体称为纯培养物，获得__________的过程就是纯培养。2．微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、______、______、分离和培养等。培养基特定种类微生物单一个体繁殖纯培养物灭菌接种\n3．酵母菌的纯培养(1)菌落：分散的微生物在适宜的____________表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的____________。(2)获得单菌落的方法：__________法和______________法。固体培养基子细胞群体平板划线稀释涂布平板\n(3)酵母菌的纯培养步骤\n1．液体培养基含有水，而固体培养基不含水。()2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。()3．用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基都要进行消毒。()4．培养基分装到培养皿后进行灭菌。()5．平板冷凝后应将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。()6．转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。()活学巧练×√××√√\n思考：1．牛肉膏蛋白胨培养基是一种常见的细菌培养基，其中牛肉膏、蛋白胨能够提供哪些营养成分？提示：牛肉膏、蛋白胨能够提供碳源、氮源、维生素(生长因子)和无机盐。\n2．在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是什么？在实验室中培养微生物应注意哪些问题？提示：在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。在实验室中培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面确保其他微生物无法混入。玉\n3．对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？提示：分别为高压蒸汽灭菌(或湿热灭菌)、干热灭菌、灼烧灭菌、化学药物消毒、紫外线消毒、巴氏消毒。4．接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？提示：划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。\n学霸记忆•素养积累\n重点呈现1．各种培养基都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。3．消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。4．灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。\n5．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。6．菌落是分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。\n课内探究•名师点睛\n知识点1．培养基的种类、特点及用途分析培养基的种类及营养要素分析划分标准种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动固体培养基微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏\n划分标准种类特点用途化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质制备)微生物的分类、鉴定\n知识贴士是否含有凝固剂(如琼脂)是区分固体培养基和液体培养基的唯一标准，含凝固剂的为固体培养基。\n2．培养基营养成分的含义、作用、主要来源分析营养物质含义作用主要来源碳源凡能提供碳元素的物质构成生物体细胞的物质和一些代谢物，有些也是异养生物的能源物质无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源凡能提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢物无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等\n营养物质含义作用主要来源无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源，酶的激活剂等无机化合物水生物体内含量很高的无机物不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定从外界摄入\n下列关于微生物培养基的说法，正确的是()A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源B．除水以外的无机物仅提供无机盐C．凡是碳源都能提供能量D．无机氮源也能提供能量典例1典例剖析D\n解析：对异养型微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，如蛋白胨既是碳源又是氮源和能源。除水以外的无机物种类繁多，如CO2和N2是无机物，分别可以作为某些微生物的碳源和氮源。CO2是自养型微生物的碳源，但不能提供能量。NaHCO3可作为自养型微生物的碳源和无机盐。硝化细菌所利用的氮源是氨，同时氨也为硝化细菌提供用于化能合成作用的能量。\n1．下表是某微生物培养基的配方。请分析回答下列问题：变式训练编号①②③④⑤成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量0.4g4.0g0.5g0.5g100mL(1)从培养基的营养成分看，此培养基可用来培养的微生物，其同化作用类型是________。利用该培养基培养微生物时，微生物所需要的碳源来自______________。自养型空气中的CO2\n(2)此表中含有的微生物的营养成分包括____________________。(3)若除去该培养基中的①后再加入不含氮元素的有机物，则此培养基可培养的微生物种类是________________。(4)培养基中若加入氨基酸，则它可充当的营养成分是______________________。(5)若要观察微生物的菌落特点，培养基中还应添加的成分是________________。H2O、无机盐、氮源自生固氮微生物碳源、氮源和特殊营养凝固剂(琼脂)\n解析：(1)从培养基的成分看，该培养基中无有机物，因此可以培养自养型微生物，此类微生物所需的碳源只能由空气中的CO2提供。(2)培养基中的成分包括微生物需要的氮源、无机盐和H2O。(3)培养基中的①是该培养基中唯一的氮源，去掉后则成为无氮培养基，可用于培养自生固氮微生物，因为自生固氮微生物可以利用大气中的N2作为氮源。(4)在培养基中加入氨基酸，可以为微生物提供碳源、氮源和特殊营养。(5)微生物的菌落需要在固体培养基的表面生长，因此培养基中需要添加凝固剂(琼脂)，使液体培养基凝固成固体培养基。\n知识点1．无菌技术的主要内容(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术分析\n2．消毒与灭菌的比较项目消毒灭菌不同点条件使用较为温和的物理、化学或生物等方法使用强烈的物理或化学方法结果杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线消毒法，使用酒精、氯气、石炭酸等化学药物进行消毒灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌适用对象操作空间、某些液体、双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等相同点消毒和灭菌的实质都是使微生物的蛋白质或核酸变性\n防止外来杂菌的入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是()A．实验室里可以用紫外线或化学药剂进行消毒B．接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌C．在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，防止被微生物感染D．使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境典例2典例剖析B\n解析：实验室里可以用紫外线或化学药剂进行消毒，也可以用煮沸消毒法或巴氏消毒法，A项正确；灼烧灭菌应该在酒精灯火焰的外焰部位灼烧，B项错误；为防止被微生物感染，切不可在实验室中吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，C项正确；使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境，D项正确。\n2．微生物的实验室培养要进行严格灭菌和消毒。下列关于灭菌和消毒的叙述，正确的是()A．灭菌和消毒均可以杀死环境中的一切微生物，包括芽孢和孢子B．无菌操作时，对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行灭菌C．灼烧法灭菌的对象是金属器具，不可以是玻璃器具D．消毒和灭菌的原理是相同的变式训练D\n解析：灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死物体表面或内部的部分微生物，不能杀死芽孢和孢子，A项错误；无菌操作时，对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行消毒，B项错误；灼烧法灭菌的对象可以是金属器具和玻璃器具，C项错误；消毒和灭菌的原理相同，都是使微生物的核酸或蛋白质变性，D项正确。\n知识点1．微生物纯培养的操作步骤微生物的纯培养\n2．倒平板操作步骤\n3．平板划线法操作步骤\n下图表示小方同学在实验室培养大肠杆菌过程中的部分操作，下列说法错误的是()A．①②③步骤需要在酒精灯火焰旁操作B．培养基中必须含碳源、氮源、无机盐和水C．③步骤接种环多方向划线是为了便于细菌计数D．接种结束后，将④倒置放入培养箱中培养典例3典例剖析C\n解析：①②③步骤依次表示倒平板、用接种环蘸取菌液、进行平板划线，为了防止被杂菌污染，操作时都需要在酒精灯火焰旁进行，A项正确；不同的微生物对营养物质的需求存在差异，但水、碳源、氮源和无机盐是各种异养型微生物所需的基本营养物质，大肠杆菌是异养型微生物，所以其培养基中必须含碳源、氮源、无机盐和水，B项正确；③步骤为平板划线法接种大肠杆菌，不能用于计数，C项错误；划线接种结束后，将④平板倒置后放入培养箱培养，防止冷凝水污染培养基，同时避免培养基中水分过快地挥发，D项正确。\n3．请回答下列与大肠杆菌纯培养有关的问题：(1)制备培养基：配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行________，培养基在接种前要进行__________灭菌。变式训练调节pH高压蒸汽\n(2)纯化大肠杆菌①通过接种环在琼脂固体培养基的表面进行连续划线的操作，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这种方法称为____________。②用该方法统计样本菌落数时______(填“需要”或“不需要”)设置对照组，为什么？____________________________。平板划线法需要可用来判断培养基是否被污染\n(3)讨论分析①纯化大肠杆菌时，______(填“可”或“不可”)用加入抗生素的方法防止杂菌感染。②用该方法分离大肠杆菌时，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，并划线数次，其原因是______________________________________________________________。③大肠杆菌与酵母菌的最本质区别是________________________。不可线条末端的细菌数量少，最终可得到由单个细菌繁殖而形成的菌落大肠杆菌无成形的细胞核\n解析：(1)配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行调节pH，培养基在接种前要进行高压蒸汽灭菌。(2)①题干所述接种方法为平板划线法。②平板划线法接种微生物时，需要进行不接种的空白培养实验，以判断培养基是否被污染，所以用该方法统计样本菌落数时需要设置对照组。(3)①大肠杆菌属于细菌，对抗生素敏感，培养大肠杆菌时不能用加入抗生素的方法防止杂菌感染。②平板划线法分离大肠杆菌时，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，并划线数次，其原因是线条的末端的细菌数量少，最终可以得到由单个细菌繁殖而形成的菌落。③大肠杆菌属于原核生物，酵母菌属于真核生物，它们最本质的区别是大肠杆菌无成形的细胞核。\n指点迷津•拨云见日\n一、倒平板操作的注意事项1．培养基灭菌后需要冷却至50℃左右时才能倒平板。温度过高，培养基凝固后皿盖上冷凝水过多，落入培养基，造成污染；温度过低，培养基又会凝固。2．将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。\n3．培养基冷却凝固后，要将培养皿倒置的原因：防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板应弃用，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。5．整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。\n二、平板划线操作的注意事项1．蘸取菌液及每次划线之前都需灼烧接种环，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的不同。项目蘸取菌液前灼烧每次划线前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物灼烧杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种均来自上次划线的末端杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者\n2．灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液或进行划线，以免温度太高，杀死菌种。3．在做第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始划线，这样才能使菌体的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个菌体繁殖而来的菌落。4．最后一次的划线不要与第一次的划线相连。5．划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。\n关于平板划线操作的叙述，错误的是()A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种C．第二次划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种典例4典例剖析C\n解析：平板划线操作中接种环蘸取菌液前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前都要灼烧接种环，是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自上次划线的末端；划线结束后仍需灼烧接种环，是为了及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。在第二次划线时，接种环上的菌种来源于第一次划线的末端。\n解疑答惑从社会中来⇨P9提示：首先酸奶制作所用容器要进行消毒晾干后使用，避免酸奶制作过程中混入杂菌；其次，准备好菌种，最好是纯的乳酸菌菌种；再有就是接种时要在无菌条件下操作，所用搅拌器要经过消毒、灭菌等。旁栏思考1⇨P10提示：微生物细胞内有蛋白质、核酸等多种含氮的营养物质，培养基中的氮源可以作为合成这些营养物质所必需的。\n旁栏思考2⇨P10提示：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。探究·实践⇨P12结果分析与评价1．提示：未接种的培养基表面若有菌落生长，则说明培养基被污染或灭菌不彻底；若无，则说明培养基未被污染且已彻底灭菌，培养基可以使用。\n2．提示：在接种大肠杆菌的培养基上可观察到独立的菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明纯化大肠杆菌的操作成功；如果培养基上出现了其他形态的菌落，则说明在纯化过程中，无菌操作还未达到要求，可能所用菌液不纯，或者在实验操作过程中被杂菌污染。3．提示：这是一个开放性题目。可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等。\n思维训练⇨P14提示：所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。可以通过查阅专业学术期刊上发表的有关研究论文，或亲自检测水果“酵素”中的成分，获取科学可靠的证据进行全面论证。\n练习与应用⇨P14一、概念检测1．(1)×提示：培养基中的营养物质浓度过高，会使微生物细胞失水，对其生长不利。(2)√提示：消毒是杀死一部分微生物，灭菌是杀死全部微生物。(3)×提示：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。2．提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。\n二、拓展应用1．提示：(1)培养基、培养皿(2)“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的接种操作。(3)通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。\n2．提示：(1)摇床转速越高，培养液中的溶氧量越多，促进酵母菌的有氧呼吸，还能增加酵母菌获得营养物质的机会，有利于其生长繁殖。(2)在一定转速范围内，摇床转速越高，酵母菌繁殖的速度和总量越高，其原因是摇床转速越高，培养基中的O2越充足。(3)培养8h后，由于营养物质逐渐被消耗，酵母菌种群密度达到K，培养液中的溶氧量和营养物质都有限，使种群密度基本达到稳定。\n训练巩固•课堂达标\n1．(2021·山西忻州一中高二期中)牛肉膏可以为微生物提供()A．碳源、氮源和维生素B．氢元素和氧元素C．碳源、氮源、磷酸盐和维生素D．碳源、氮源和无机盐解析：牛肉膏富含碳源、氮源、无机盐(磷酸盐)等各种微生物生长必需的营养物质，还含有维生素。C\n2．下列操作属于灭菌的是()A．接种前用火焰灼烧接种环B．接种前用酒精擦拭双手C．将平板倒置，放入培养箱中培养D．接种在酒精灯的火焰旁完成解析：要正确区分灭菌、消毒和防止杂菌污染的措施。A属于灭菌，B属于消毒，C、D都是实验操作过程中防止杂菌污染的措施，与灭菌无关。A\n3．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是()A．对比观察培养基有没有被微生物利用B．对比分析培养基上是否生有杂菌C．没必要放入未接种的培养基D．为了下次接种时再使用解析：通过设计对照实验，目的是检测培养基制备是否成功，即是否污染了杂菌，如果接种后的培养基和未接种的培养基均有菌落生成，则表示培养基受到污染；如果未接种的培养基上没有菌落生长，则表示培养基没有受到污染。B\n4．(不定项)下列对灭菌和消毒的理解正确的是()A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质上是完全相同的C．接种环用灼烧法灭菌D．常用的灭菌方法有灼烧灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法ACD\n解析：灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子的过程，A正确。消毒是仅杀死物体表面或内部的一部分微生物的过程，灭菌则是杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子。灭菌一定可以达到消毒的目的，但消毒不一定能达到灭菌的效果，B错误。接种环是金属工具，可以用灼烧灭菌或干热灭菌法灭菌，C正确。常用的灭菌方法有灼烧灭菌法、干热灭菌法、湿热灭菌法，D正确。\n5．酵母菌与人们的日常生活密切相关，它是生物科学研究中的重要生物之一。请根据所学知识，回答下列有关酵母菌的问题：(1)土壤中富含各种微生物，将其浸出液接种到特定培养基上，可获得较纯的酵母菌，这一过程叫作______________。若想对初步筛选得到的酵母菌进行纯化，可采用的接种方法是____________。(2)在培养酵母菌的过程中，对培养基、接种环常采用的灭菌方法分别是______________、__________。在酵母菌的培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑______________________________(答出两点)等条件。酵母菌的分离平板划线法高压蒸汽灭菌灼烧灭菌温度、pH、渗透压(任选两点)\n(3)酵母菌马铃薯培养基中为酵母菌提供碳源的是________________________________。在配制酵母菌培养基时添加葡萄糖(或蔗糖)要注意浓度不能太高，否则会抑制酵母菌生长，这是因为__________________________________________________。马铃薯中的糖类、葡萄糖(蔗糖)添加葡萄糖或蔗糖的浓度太高，会导致酵母菌失水\n解析：(1)从土壤浸出液获得较纯的酵母菌，这一过程叫作酵母菌的分离。可采用平板划线法对初步筛选得到的酵母菌进行纯化。(2)培养酵母菌的过程中，对培养基、接种环常采用的灭菌方法分别是高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养酵母菌要考虑营养、温度、pH、渗透压等。(3)马铃薯中富含淀粉等糖类，可以为酵母菌提供碳源，以及添加的葡萄糖或蔗糖也能为酵母菌提供碳源。添加的葡萄糖或蔗糖如果浓度太高，会导致酵母菌失水，从而抑制酵母菌的生长。