第2章　细胞工程\n第2节　动物细胞工程\n二　动物细胞融合技术与单克隆抗体\n学霸记忆•素养积累训练巩固•课堂达标新知预习•双基夯实课内探究•名师点睛指点迷津•拨云见日\n新知预习•双基夯实\n一、动物细胞融合技术1．概念使____________________结合形成一个细胞的技术。2．诱导原理和结果(1)诱导原理：________________。(2)诱导结果：形成______细胞。3．诱导方法：_________法、电融合法和______________法等。4．意义：突破了__________的局限，使__________成为可能。两个或多个动物细胞细胞膜的流动性杂交PEG融合灭活病毒诱导有性杂交远缘杂交\n5．动物细胞融合技术的应用(1)成为研究__________、__________、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(2)用于制备____________。细胞遗传细胞免疫单克隆抗体\n二、单克隆抗体1．制备原理(1)B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞分泌一种特异性抗体。(2)骨髓瘤细胞特点：能在体外大量______。(3)杂交瘤细胞特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能__________又能产生大量__________。增殖无限增殖特定抗体\n2．制备过程\n3．单克隆抗体的优点能准确地识别________________，与特定抗原发生特异性结合，并且可以__________。4．单克隆抗体的应用(1)作为__________，具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于__________和__________。抗原的细微差异大量制备诊断试剂治疗疾病运载药物\n1．动物细胞融合过程中既有细胞膜融合也有核的融合。()2．与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒。()3．用特定的抗原对小鼠进行免疫后，从小鼠脾脏中只能得到一种B淋巴细胞。()4．单克隆抗体是单个B淋巴细胞增殖并产生的抗体。()5．单克隆抗体制备过程中的两次筛选目的相同。()活学巧练√××××\n思考：1．什么是灭活？灭活病毒诱导融合的原理是什么？提示：灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。\n2．动物细胞融合与植物原生质体融合的原理相同吗？提示：相同，都依据细胞膜的流动性。3．制备单克隆抗体的过程中的几种细胞，如免疫的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞各有何特点？提示：免疫的B淋巴细胞：能产生单一抗体，但不能无限增殖；骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体；杂交瘤细胞：既能产生特定的抗体，又能在组织培养条件下进行无限增殖。\n4．细胞内DNA的合成一般有两条途径，主要途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基蝶呤可以阻断此途径。辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶的催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。如何利用DNA合成途径不同的特点配制培养基筛选出杂交瘤细胞？请说明原理。提示：在培养基中加氨基蝶呤就可以筛选出杂交瘤细胞。因为培养基中加入氨基蝶呤后，骨髓瘤细胞和两两融合的骨髓瘤细胞由于其唯一的DNA合成途径被抑制而不能增殖。B淋巴细胞本身不增殖，两两融合的B淋巴细胞也不增殖，只有杂交瘤细胞通过辅助途径合成DNA进行增殖。\n学霸记忆•素养积累\n1．动物细胞融合是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。2．动物细胞融合常用的诱导方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法。3．动物细胞融合的主要用途是制备单克隆抗体。4．杂交瘤细胞是由经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合而成的，具有既能无限增殖又能产生专一抗体的能力。\n5．制备单克隆抗体过程中第一次筛选是为了获得杂交瘤细胞，第二次筛选是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。6．单克隆抗体最主要的优点是特异性强、灵敏度高，并可大量制备。7．单克隆抗体的主要用途有：作为诊断试剂、用于治疗疾病和运载药物。\n课内探究•名师点睛\n知识点1．对动物细胞融合过程的理解(1)细胞融合的过程包括细胞膜的融合、细胞质融合和细胞核融合，其中细胞膜的融合是细胞融合的先导，在细胞膜融合中体现出细胞膜具有一定的流动性。(2)动物细胞融合完成的标志：来自不同细胞的两个或多个细胞核融合成一个细胞核。动物细胞融合\n2．动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较比较项目动物细胞融合(单克隆抗体制备)植物体细胞杂交(番茄—马铃薯植株)过程正常小鼠的处理(注射特定的抗原)原生质体的制备(酶解法)动物细胞融合原生质体的融合杂交瘤细胞的筛选和培养杂种细胞的筛选和培养提纯单克隆抗体(特异性强、灵敏度高)杂种植株鉴定\n比较项目动物细胞融合(单克隆抗体制备)植物体细胞杂交(番茄—马铃薯植株)原理细胞膜的流动性、细胞增殖细胞膜的流动性、植物细胞的全能性融合前处理注射特定抗原，免疫处理正常小鼠酶解法去除细胞壁：纤维素酶、果胶酶诱导方法(1)物理法：电融合法等(2)化学法：PEG融合法等(3)生物法：灭活病毒诱导法等(1)物理法：电融合法、离心法等(2)化学法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等意义和用途(1)制备单克隆抗体(2)有助于疾病的诊断、治疗、预防(1)克服不同物种间远缘杂交不亲和的障碍(2)培育作物新品种\n知识贴士病毒在生物技术中的应用(1)灭活的病毒能作为诱导剂，不灭活的病毒不能作为诱导剂。(2)病毒在不同过程或操作中的“身份不同”。在免疫调节中病毒属于抗原，在基因工程中可作为载体，在细胞工程中可作为诱导剂。\n动物细胞融合的目的中最重要的是()A．克服远缘杂交不亲和的障碍B．制备单克隆抗体C．培育新物种D．生产杂交细胞典例1典例剖析B\n解析：植物体细胞杂交主要是为了克服远缘杂交不亲和的障碍，以培育新品种；植物体细胞杂交还应用了植物体细胞的全能性；动物细胞的全能性受到限制，目前还未见到融合细胞表现出全能性的例子，因此动物细胞融合不能用来培育新物种；生产杂交细胞不是细胞融合的主要目的，杂交细胞只是细胞融合完成后所形成的结构名称。\n1．下列关于动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，叙述正确的是()A．诱导融合的方法完全相同B．所用的技术手段完全相同C．所采用的原理完全相同D．都能形成杂种细胞变式训练D\n解析：植物体细胞杂交诱导融合的方法有物理法、化学法，动物细胞融合的诱导方法有物理法、化学法和生物法；两者采用的原理不同，动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性，最终形成的是杂种细胞，植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性和细胞的全能性。\n知识点1．单克隆抗体的制备过程单克隆抗体\n2．两种抗体的比较名称产生特点血清抗体由浆细胞分泌一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强，灵敏度高，能大量制备\n3．三种细胞的比较细胞类型来源特点浆细胞由B淋巴细胞受抗原刺激后增殖分化而来能产生单一抗体，但不能无限增殖骨髓瘤细胞从骨髓肿瘤中提取能无限增殖，但不能产生抗体杂交瘤细胞浆细胞与骨髓瘤细胞融合而成既能产生抗体，又能无限增殖\n4．单克隆抗体制备过程中两次筛选的区别项目项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后会得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长用多孔板培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞\n单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不能存活、增殖的细胞是()①B淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．①②③④B．①③⑤C．②④D．①③典例2典例剖析A\n解析：特定培养基培养细胞的目的是筛选出既能大量增殖，又能产生抗体的杂交瘤细胞，因此其他的细胞都不能在此培养基上生存。在这种培养基上不能存活和繁殖的细胞有①B淋巴细胞、②小鼠骨髓瘤细胞、③B淋巴细胞自身融合细胞、④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞。\n2．下列有关单克隆抗体的制备的叙述，正确的是()A．小鼠骨髓瘤细胞染色体数为40，其B淋巴细胞的染色体数为40，融合后形成的杂交瘤细胞DNA分子数为80B．在单克隆抗体的制备过程中，只有一次筛选C．单克隆抗体的制备需要用到动物细胞培养、动物细胞融合和动物体细胞核移植等技术D．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经细胞融合后有三种细胞类型(若仅考虑两两融合的情况)变式训练D\n解析：小鼠骨髓瘤细胞染色体数为40，其B淋巴细胞的染色体数为40，融合后形成的杂交瘤细胞染色体数目为80，由于线粒体中也有DNA，所以DNA数目大于80，A项错误；在单克隆抗体的制备过程中，至少涉及两次筛选，B项错误；单克隆抗体的制备需要用到动物细胞培养、动物细胞融合等技术，C项错误；B淋巴细胞与骨髓瘤细胞经细胞融合后有三种两两融合的细胞类型，即杂交瘤细胞、B淋巴细胞—B淋巴细胞、骨髓瘤细胞—骨髓瘤细胞，D项正确。\n指点迷津•拨云见日\n一、杂交瘤细胞与单克隆抗体杂交瘤细胞的抗体检测和克隆化培养融合后的细胞经选择培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用96孔板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体(常用酶联免疫吸附试验法)，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。\n二、培养杂交瘤细胞的方法项目腹腔培养体外培养优点易于控制培养条件，成本较低可大规模培养、大量生产缺点规模小，产量少需要人为控制培养条件，成本相对较高\n三、获取单克隆抗体的场所若在培养基中进行杂交瘤细胞培养，则从培养液中提取；若在小鼠或其他动物腹腔中培养，则从腹水中提取。\n下列各图表示单克隆抗体制备过程的各阶段图解。请根据图分析下列四个选项，其中说法不正确的一项是()典例3典例剖析\n答案：D\n\n解疑答惑旁栏思考⇨P49提示：病毒介导了细胞的融合，形成多核细胞。思考·讨论⇨P501．提示：ADC的抗体在生物体内与特定目标细胞或组织相结合，具有导向作用。药物起治疗作用。\n2．提示：可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。3．提示：单克隆抗体诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、可大量制备的优势。ADC在临床上用于治疗癌症或其他疾病，具有疗效高、毒副作用小的特点。4．提示：单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。\n练习与应用⇨P51一、概念检测1．C(2)A提示：一个B淋巴细胞不能无限增殖，B项错误。经诱导后的细胞还有未融合的亲本细胞和同种细胞融合后的细胞，C项错误。小鼠体内产生的特异性抗体的种类很多，从血清中分离出的抗体不是单克隆抗体，D项错误。\n二、拓展应用开放性问题，答案略。\n训练巩固•课堂达标\n1．动物细胞融合中常用到灭活的病毒，如灭活的仙台病毒，病毒被灭活后它的抗原性和感染力是()A．失去抗原性，具有感染力B．失去抗原性，失去感染力C．具有抗原性，失去感染力D．具有抗原性，具有感染力解析：灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但不破坏它们的抗原结构，因此灭活的病毒具有抗原性，失去感染能力。C\n2．下列关于动物细胞融合的说法，错误的是()A．动物细胞融合是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程B．动物细胞融合需要用纤维素酶处理C．动物细胞融合时需要人工诱导D．常用的诱导动物细胞融合的因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等B\n解析：动物细胞融合是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，A项正确；动物细胞无细胞壁，所以诱导融合前不需要用纤维素酶处理，B项错误；动物细胞融合需要人工诱导融合，常用的诱导因素包括聚乙二醇、灭活的病毒、电激等，C、D两项正确。\n3．从小鼠脾脏获取B淋巴细胞，从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞，在试管中用促融剂使两者细胞融合后得到杂交瘤细胞。试管中两两融合的细胞至少有几种()A．1种B．2种C．3种D．无数种解析：在试管中用促融剂使B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，若只考虑细胞两两融合的情况，则试管中至少有3种细胞，即B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。C\n4．(不定项)单克隆抗体技术在生物工程中占有重要的地位，下列有关单克隆抗体应用的叙述正确的是()A．作为诊断试剂，具有准确、高效、快速、简易的优点B．作为诊断试剂，可定位诊断肿瘤、心血管畸形、白化病等疾病C．从临床试验来看，单克隆抗体主要用于癌症治疗D．在ADC(抗体—药物偶联物)中，单克隆抗体的作用是定位而不是杀伤ACD\n解析：单克隆抗体在临床诊断的应用上，具有准确、高效、简易、快速的优点，A正确；白化病的表现型非常直观，不需要单克隆抗体定位诊断，B错误；临床试验中，单克隆抗体主要用于癌症治疗，C正确；在ADC(抗体—药物偶联物)中，单克隆抗体的作用是定位，起杀伤作用的是与其相连接的药物，D正确。\n5．单克隆抗体的制备过程如下图所示。(1)植物体细胞杂交和单克隆抗体制备，都应用了细胞融合技术，电激和聚乙二醇都可以诱导相应的细胞融合，在诱导动物细胞融合时，还可以用____________。细胞融合的原理是________________。(2)融合后的细胞，仅仅由2个细胞互相融合的类型有____种，其中符合要求的细胞是____________，其特点为________________________________。灭活的病毒细胞膜的流动性3杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生抗体\n(3)向动物体内反复注射某种抗原，并从动物血清中分离出抗体，这种抗体与单克隆抗体相比，存在的缺点是__________________________(至少答2个)。由单克隆抗体技术研制成的“生物导弹”由两部分构成，其中一部分被称为“瞄准装置”，它作用的原理是________________，其特点为__________。产量低、纯度低、特异性差抗原与抗体杂交特异性强\n解析：(1)在诱导动物细胞融合时，可用灭活的病毒诱导融合。细胞融合的原理是细胞膜的流动性。(2)融合后的细胞，仅仅由2个细胞互相融合的类型有3种：B淋巴细胞与B淋巴细胞融合的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的细胞、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，其中符合要求的细胞是杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量增殖，又能产生抗体。(3)与单克隆抗体相比，用传统方法生产的血清抗体存在的缺点是产量低、纯度低、特异性差。生物导弹是将单克隆抗体与放射性同位素、化学药物或细胞毒素相结合，注入体内，借助单克隆抗体的导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞，其“瞄准装置”为单克隆抗体，它作用的原理是抗原与抗体杂交，特点是特异性强。