第3章　基因工程\n第1节　重组DNA技术的基本工具\n课标要求核心素养1．理解基因工程的概念。(生命观念)2．列表比较不同的限制酶、DNA连接酶的差异，区分DNA连接酶与DNA聚合酶。(生命观念)3．结合实例分析基因工程载体必须满足的条件。(生命观念、科学思维)4．学会DNA的粗提取与鉴定方法。(科学探究)1．阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3．进行DNA的粗提取与鉴定。\n知识导图\n学霸记忆•素养积累训练巩固•课堂达标新知预习•双基夯实课内探究•名师点睛指点迷津•拨云见日\n新知预习•双基夯实\n一、基因工程及其诞生与发展1．基因工程的概念(1)操作场所：__________。(2)操作技术：________等技术。(3)操作结果：赋予生物新的__________，创造出更符合人们需要的新的__________和生物产品。(4)操作水平：_________水平。生物体外转基因遗传特性生物类型DNA分子\n2．基因工程的诞生和发展(1)基因工程的诞生①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了__________________，还证明了________________________________________。②1953年，沃森和克里克建立了_______________模型并提出了__________________的假说。③1961年，尼伦伯格和马太破译了__________________________。遗传物质DNA可以在同种生物的不同个体之间转移DNA双螺旋结构遗传物质自我复制第一个编码氨基酸的密码子是DNA\n④20世纪70年代初，__________酶、_________酶和________酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。⑤1973年，科学家证明______可以作为基因工程的载体，构建_________，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。多种限制DNA连接逆转录质粒重组DNA\n(2)基因工程的发展①1982年，第一个基因工程药物——______________被批准上市。②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出________________________。③1985年，穆里斯等人发明_____，为获取目的基因提供了有效手段。重组人胰岛素世界上第一条转基因鱼PCR\n④1990年，____________计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。⑤21世纪以来，科学家发明了多种________________，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因序列的了解。⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的____________技术编辑了哺乳动物基因组。人类基因组高通量测序技术基因组编辑\n二、DNA重组技术的基本工具1．限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子手术刀”(1)来源：主要来自__________。(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定____________，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________断开。(3)结果：产生__________或________。原核生物核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端\n(4)应用：已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的__________不同，切割位点______(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有________。碱基序列不同专一性\n2．DNA连接酶——“分子缝合针”(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________。(2)种类[填表]种类比较E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源_____________________特点只能连接__________既可以连接黏性末端，又可以连接________磷酸二酯键大肠杆菌T4噬菌体黏性末端平末端\n3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)质粒①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于____________________或_________________之外，并具有__________能力的环状双链DNA分子。真核细胞的细胞核原核细胞拟核DNA自我复制\n②质粒适于作基因运载体的特点Ⅰ.质粒分子上有一个至多个____________位点，供外源DNA片段插入其中。Ⅱ.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中______________，或___________________，随_______________同步复制。Ⅲ.人工改造的质粒常带有_________，便于___________________。(2)噬菌体、动植物病毒等。限制酶切割进行自我复制整合到受体DNA上受体细胞DNA标记基因重组DNA分子的筛选\n三、重组DNA分子的模拟操作1．材料用具：剪刀代表________，透明胶条代表____________。2．切割位点(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出____________________序列，并选______之间作切口进行“切割”。(2)再从另一条链上____________之间寻找EcoRⅠ相应的切口剪开。3．操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能__________；否则，说明操作有误。EcoRⅠDNA连接酶G—A—A—T—T—CG—A互补的碱基互补配对\n四、DNA的粗提取与鉴定1．实验原理(1)_____不溶于酒精，________溶于酒精。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__________________溶液。(3)在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现蓝色。DNA蛋白质2mol/L的NaCl二苯胺\n2．实验步骤(1)称取30g洋葱，切碎，加入10mL研磨液，充分研磨。↓(2)漏斗中垫______，将研磨液过滤到烧杯中，____℃处理，取上清液。↓(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的______溶液，静置2～3min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。↓纱布4酒精\n(4)取两支20ml的试管编号A、B，各加入2mol/L的______溶液5mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4mL的____________。混匀后，将试管置于______中加热5min。↓(5)结果观察：A试管________，B试管________。NaCl二苯胺试剂沸水不变蓝变蓝色\n1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。()2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。()3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。()4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。()5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。()6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。()活学巧练√××√×√\n思考：1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。\n2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coliDNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。\n3．细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。\n4．如何检测(重组)质粒是否导入受体细胞？提示：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。\n学霸记忆•素养积累\n1．基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。4．E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。\n5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。8．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。9．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。\n课内探究•名师点睛\n知识点1．限制酶与DNA连接酶的比较与DNA分子相关的几种酶的比较项目限制酶DNA连接酶不同点作用使特定部位的磷酸二酯键断裂在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键应用用于提取目的基因和切割载体用于基因表达载体的构建关系\n2．限制酶与解旋酶的比较限制酶与解旋酶的作用部位不同，前者作用于磷酸二酯键，后者作用于氢键。\n3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较种类DNA连接酶DNA聚合酶相同点催化形成磷酸二酯键不同点模板不需要模板需要以DNA的一条链为模板作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键作用结果形成完整的DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程等DNA复制\n4．DNA水解酶和解旋酶(1)DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，然后再彻底水解成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基。(2)解旋酶：能够将DNA或DNA的某一片段分解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。\n5．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位图解(1)作用于磷酸二酯键的酶：限制酶(a断开)、DNA连接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a断开)。(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。\n知识贴士氢键的形成是由于分子间的作用力，其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。\nMseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ三种限制酶的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC，下图中图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。典例1典例剖析\n若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒，需要对质粒进行改造，构建新的限制酶酶切位点。在构建新的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是()A．限制酶PstI、DNA连接酶、DNA聚合酶B．限制酶EcoRI、DNA连接酶、DNA聚合酶C．限制酶EcoRI、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶D．限制酶PstⅠ、限制酶EcoRI、DNA连接酶B\n解析：对质粒进行改造是让它增加一种限制酶的酶切位点，其他酶切位点又不能被破坏，故只能用EcoRI切割质粒后增加一部分含有MseⅠ酶切位点的片段，这样保证了在基因工程中目的基因和抗性基因结构的完整性。因此，应先用限制酶EcoRI切割，然后用DNA聚合酶合成MseⅠ酶的识别序列，最后利用DNA连接酶形成环状质粒。\n1．对下图所示黏性末端的说法，正确的是()A．甲、乙、丙黏性末端是由两种限制性内切核酸酶作用产生的B．图乙中的酶切位点在A与G之间C．如果甲中的G突变为A，则原限制性内切核酸酶不能识别该切割位点D．构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶分别作用于a处和b处变式训练C\n解析：根据题图结果可知，切割甲的限制酶的识别序列是—GAATTC—，切割乙的限制酶的识别序列是—CAATTG—，切割丙的限制酶的识别序列是—CTTAAG—，故甲、乙、丙三个黏性末端是由三种限制酶作用产生的，A项错误；图乙中的酶切位点在A与C之间，而不是A与G之间，B项错误；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，如果甲中的G发生突变，则限制酶不能识别该切割位点，C项正确；构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶的作用位点均是磷酸二酯键，b处为氢键，D项错误。\n知识点根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。选择限制酶的方法\n(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。\n知识贴士不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。\n利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是()典例2典例剖析\nA．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA答案：D\n解析：构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A项正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcoRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B项正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C项正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，不止能产生一种重组DNA，D项错误。\n2．下图表示4种限制酶的识别序列及酶切位点，下列叙述错误的是()A．不同类型的限制酶切割后，有的产生黏性末端，有的产生平末端B．不同类型的限制酶切割后可能产生相同的黏性末端C．用酶1和酶2分别切割目的基因和质粒，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子仍能被酶2识别D．用酶3和酶4分别切割目的基因和质粒后，其产物经T4DNA连接酶催化不能连接形成重组DNA分子变式训练D\n解析：不同类型的限制酶切割后，有的产生黏性末端(酶1和酶2)，有的产生平末端(酶3和酶4)，A项正确；不同类型的限制酶切割后可能产生相同的黏性末端，如图中的酶1和酶2，B项正确；用酶1和酶2分别切割目的基因和质粒，形成的黏性末端序列相同，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子仍能被酶2识别，C项正确；用酶3和酶4分别切割目的基因和质粒后，其产物经T4DNA连接酶催化可以连接形成重组DNA分子，D项错误。\n知识点1．载体的功能(1)作为运载工具将目的基因转运到宿主细胞内。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”\n2．常用的载体——质粒(1)存在场所：细菌、真菌等生物的细胞质。(2)本质：环状DNA分子。(3)特点：含有标记基因。(4)载体必须具备的条件①能在受体细胞内稳定保存并大量复制。②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有某些标记基因，以便进行筛选。④载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。\n知识贴士基因工程中的载体与载体蛋白的区别基因工程中的载体载体蛋白来源细菌的质粒、噬菌体、动植物病毒细胞膜上的蛋白质作用将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制运载要进出细胞的某些物质\n作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是()A．能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合D．对受体细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择典例3典例剖析A\n解析：作为载体必须能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的鉴定和选择，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便受体细胞能进行正常的生命活动，D错误。\n3．某目的基因两侧的DNA序列所含限制酶的酶切位点如图所示，则在进行基因工程操作中最好应选用下列哪种质粒作为载体()变式训练D\n解析：目的基因只有一侧含有限制酶NheⅠ的识别序列，因此不能只用该酶获取目的基因，A错误；目的基因的两侧都含有限制酶AluⅠ的识别序列，可以用该酶获取目的基因，但只用此酶切割可能会导致目的基因和质粒的反向连接和自身环化，B错误；目的基因的一侧同时含有限制酶NheⅠ和AluⅠ的识别序列，故用这两种酶切割可能会获得不含目的基因的片段，C错误；目的基因两侧分别含有限制酶NheⅠ和SmaⅠ的识别序列，用这两种酶切割能获取目的基因，而且能防止目的基因和质粒的自身环化和反向连接，D正确。\n知识点DNA的粗提取与鉴定\n2．实验流程(1)实验材料的选取。选用DNA含量相对较高的生物材料，如新鲜洋葱。(2)破碎细胞，获取含DNA的滤液。称取约30g洋葱切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨，纱布过滤后收集研磨液，在4℃冰箱中放置几分钟，获取上清液。也可以直接将研磨液倒入离心管中，1500r/min离心5min，再取上清液。\n(3)去除滤液中的杂质。在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷取丝状物，用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，10000r/min离心5min，取沉淀物晾干。(4)DNA的鉴定。将丝状物或沉淀物溶解于5mL物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中，再加入4mL的二苯胺试剂，将试管置于沸水中加热。5min，冷却后观察溶液的颜色，注意要同时设置对照实验。\n下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是()A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料B．DNA既溶于2mol/LNaCl溶液也溶于蒸馏水C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色絮状物D．DNA溶液加入二苯胺试剂，沸水浴加热，冷却后变蓝典例4C\n解析：原则上含DNA的生物材料都可用来提取DNA，只是选用DNA含量高的生物组织，成功的可能性更大；DNA在2mol/LNaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，但在蒸馏水中不会析出DNA；DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后溶液变蓝。\n4．在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是()变式训练组别实验材料提取核物质时加入的溶液去除杂质时加入的溶液DNA鉴定时加入的试剂甲鸡血蒸馏水体积分数为95%的酒精溶液(25℃)二苯胺乙菜花蒸馏水体积分数为95%的酒精溶液(冷却)双缩脲试剂丙猪血蒸馏水体积分数为95%的酒精溶液(冷却)二苯胺丁鸡血蒸馏水体积分数为95%的酒精溶液(冷却)二苯胺\nA．实验材料选择错误的组别是丙B．沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁C．甲组实验现象差的原因是25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差D．乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂答案：D\n解析：鸡血、菜花细胞中都含有DNA，而猪是哺乳动物，其成熟的红细胞中不含DNA，A项正确；甲、乙、丁的实验材料中都含有DNA，但乙为植物，将植物细胞放入蒸馏水中时，植物细胞不会吸水涨破，且DNA应该用二苯胺鉴定，而不能用双缩脲试剂鉴定，因此沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁，但因为25℃的酒精溶液对DNA的凝集效果差，所以甲组蓝色浅，B、C项正确，D项错误。\n指点迷津•拨云见日\n与DNA有关的酶的作用底物、作用部位和形成产物种类作用底物作用部位形成产物限制酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA连接酶DNA分子片段磷酸二酯键重组DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键新的DNA分子解旋酶DNA分子氢键单链DNADNA水解酶DNA分子磷酸二酯键磷酸、脱氧核糖、含氮碱基\n下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A．①②③④B．①②④③C．①④②③D．①④③②典例5典例剖析C\n解析：分析题图可知，①是切割DNA分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性内切核酸酶；②是黏性末端连接的过程，需要DNA连接酶；③是DNA分子解旋的过程，需要解旋酶；④是DNA复制过程，需要DNA聚合酶。\n解疑答惑从社会中来⇨P70提示：用到的“分子工具”：限制性内切核酸酶、DNA连接酶、载体。限制性内切核酸酶的特征：准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。DNA连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。载体的特征：能将目的基因导入受体细胞中。\n旁栏思考1⇨P71提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是其在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，限制酶就是一种防御性工具。当外源DNA入侵时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，使之失效，从而保护自身的作用。\n旁栏思考2⇨P72提示：不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E.coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到的，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键(在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成)，那么，二者的差别主要表现如下：\n(1)DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。\n思考·讨论⇨P731．提示：“剪刀”代表限制酶，“透明胶条”代表DNA连接酶。2．提示：如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选择不对(也可能是其他原因)。比如在书写将要重组的两个DNA分子时，一定要具有同一种限制酶的识别和切割位点，这样切割后才会露出相同的黏性末端；否则黏性末端不同，碱基就无法配对。3．提示：不能。真正的基因是有遗传效应的DNA片段，且含有几百至几千个不等的碱基对。\n探究·实践⇨P73结果分析与评价1．提示：观察提取的DNA颜色：如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺法鉴定：二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新提取。\n2．提示：本实验提取的DNA粗制品中有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。3．提示：本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。\n进一步探究提示：DNA纯化常用方法：将DNA黏稠物再溶解，继续用物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液20mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3min，使DNA充分溶解，以免损失。用3～4层纱布进行过滤(或离心)，滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50mL预冷的体积分数为95%的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液中会出现DNA丝状物。\n此外，还有许多其他方法。例如，添加质量分数为25%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，使蛋白质变性后与DNA分开。随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24∶1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液。可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于酚层中，这时可用分液漏斗或吸管等仪器将二者分开。\n练习与应用⇨P74一、概念检测1．C提示：DNA连接酶的作用是连接两个DNA分子片段，既能连接黏性末端，也能连接平末端，形成磷酸二酯键。DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。2．A提示：基因工程中使用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。\n二、拓展应用1．提示：细菌中的限制酶之所以不剪切自身DNA，是因为细菌在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化将甲基转移到限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。\n2．提示：(1)限制酶XbaⅠ。因为限制酶XbaⅠ切割B片段产生的黏性末端与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的黏性末端相同。(2)识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。\n训练巩固•课堂达标\n1．科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程，实施该工程的最终目的是()A．定向提取生物体的DNA分子B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”C．在生物体外对DNA分子进行改造D．定向地改造生物的遗传性状D\n解析：基因工程的定义就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就定向地改造了生物的遗传性状。\n2．在基因工程中，科学家所用的“剪刀”“针线”和“载体”分别是指()A．大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶B．噬菌体、质粒、DNA连接酶C．限制酶、RNA连接酶、质粒D．限制酶、DNA连接酶、质粒解析：基因工程是在分子水平上操作，对DNA分子进行操作的工具，主要有“剪刀”——限制酶、“针线”—DNA连接酶、“载体”——质粒、动植物病毒等。D\n3．下列有关DNA连接酶的叙述正确的是()①催化具有相同的黏性末端的DNA片段之间连接②催化具有不同的黏性末端的DNA片段之间连接③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成④催化脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成A．①②B．③④C．①④D．②③解析：DNA连接酶催化相同(即互补)的黏性末端进行连接，而不是不同的黏性末端的任意连接。DNA连接酶作用的部位是磷酸二酯键，不是氢键。C\n4．(不定项)下列关于载体的叙述中，正确的是()A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子B．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的C．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割ABC\n解析：用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成的DNA分子为重组DNA分子，A正确；在基因工程中目前用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，B、C正确；标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，D错误。\n5．根据基因工程的有关知识，回答下列问题。(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有__________和________。(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：AATTC……GG……CTTAA该酶识别的序列为____________________，切割的部位是__________________________。黏性末端平末端5′－GAATTC－3′G和A之间的磷酸二酯键\n(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是____________________________________。(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即_____DNA连接酶和_________DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。(5)基因工程中除质粒外，________和____________也可作为载体。两种限制酶切割后形成的黏性末端相同T4E．coli噬菌体动植物病毒\n解析：(1)限制酶切割DNA分子后可产生两种类型的末端，即平末端和黏性末端。(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的5′－GAATTC－3′，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶Y切割，说明这两种限制酶切割产生的黏性末端相同。(4)基因工程常用的DNA连接酶，按来源可分为E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E.coliDNA连接酶。(5)基因工程的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。