第3章　基因工程\n第2节　基因工程的基本操作程序\n课标要求核心素养1．掌握目的基因的筛选与获取方法。(科学思维、生命观念)2．学会基因表达载体构建的方法和要求。(科学探究)3．理解目的基因导入受体细胞的具体过程。(科学探究)4．掌握目的基因检测与鉴定的方法。(科学探究、社会责任)5．掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的方法。(科学探究)1．概述基因工程的基本操作程序。2．说明利用PCR技术扩增目的基因的基本过程。3．理解基因表达载体的结构和各部分的作用及基因表达载体的构建。4．举例说明获取目的基因的途径，目的基因导入受体细胞的方法、检测与鉴定目的基因的方法。\n知识导图\n学霸记忆•素养积累训练巩固•课堂达标新知预习•双基夯实课内探究•名师点睛指点迷津•拨云见日\n新知预习•双基夯实\n一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变______________或获得______________等的基因。(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是________________。受体细胞性状预期表达产物Bt抗虫蛋白基因\n2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的__________和__________的基因中进行筛选。(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的__________，也对Bt基因的表达产物____________有了较为深入的了解。(3)认识基因结构和功能的技术方法：_________技术、__________数据库、__________工具。已知结构功能清晰序列信息Bt抗虫蛋白DNA测序遗传序列序列比对\n3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是________________的缩写，它是一项根据_______________的原理，在体外提供_____________的各种组分与反应条件，对______________________进行大量复制的技术。(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种______、四种____________、___________________。聚合酶链式反应DNA半保留复制参与DNA复制目的基因的核苷酸序列引物脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合酶\n(3)过程：①变性：温度上升到90℃以上，目的基因DNA____________________。②复性：温度下降到50℃左右时，__________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中________________在耐高温的___________的作用下加到引物的______端合成子链。④重复循环多次。(4)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成______形式扩增(约为2n)。受热变性后解为单链两种引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶3′指数\n二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中__________，并且可以______给下一代。(2)使目的基因能够______和发挥作用。稳定存在遗传表达\n2．基因表达载体的组成[填图]\n3．基因表达载体的构建首先用一定的________切割载体，使它出现一个切口，然后用______限制酶或________________的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用___________将目的基因片段拼接到载体的切口处。限制酶同种能产生相同末端DNA连接酶\n三、将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内__________和______的过程。2．目的基因导入受体细胞的方法(1)目的基因导入植物细胞①花粉管通道法Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入______中。Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借____________进入______。维持稳定表达子房花粉管通道胚囊\n②农杆菌转化法Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染________植物和______植物；农杆菌的Ti质粒上的________能够整合到所侵染细胞的___________上。Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌________________中，让农杆菌侵染植物细胞。双子叶裸子T－DNA染色体DNATi质粒的T－DNA\n(2)目的基因导入动物细胞①常用方法：__________法。②常用受体细胞：________。(3)目的基因导入微生物细胞①方法：用________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。显微注射受精卵Ca2＋\n四、目的基因的检测与鉴定1．分子水平检测(1)通过_____等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行____________杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2．个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。PCR抗原—抗体\n1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。()2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。()3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。()4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。()活学巧练√××√\n5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。()6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。()×√\n思考：1．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。提示：在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。\n2．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？提示：第3轮\n3．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。\n4．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。\n学霸记忆•素养积累\n1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。2．PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。3．PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。\n4．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。5．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。\n6．将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。7．分子水平的检测：检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中；检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。8．目的基因的检测与鉴定也可以在个体生物学水平进行鉴定。\n课内探究•名师点睛\n知识点1．目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。2．获取方法(1)从基因文库中获取。(2)利用PCR技术扩增。(3)通过化学方法人工合成。目的基因的获取\n3．PCR反应(1)条件①模板：DNA母链(目的基因所在的DNA片段)。②酶：耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。③两种引物：分别与两条模板链相结合。④原料：四种脱氧核苷酸。\n(2)过程过程说明图解变性温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链复性温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合\n过程说明图解延伸温度上升到72℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸\n(3)结果上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。\n知识贴士关于引物①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20～30个核苷酸。\n②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，见下图：\nPCR是一种体外扩增DNA的技术，模拟了体内的DNA复制过程。下图为PCR技术原理示意图，对于图中物质和过程的说明，错误的是()A．物质a：游离的脱氧核苷酸B．过程①：氢键断裂C．过程②：边解旋边复制D．过程③：遵循碱基互补配对原则典例1典例剖析C\n解析：PCR模拟了体内的DNA复制，所以a是DNA复制的原料——脱氧核苷酸，A项正确；在94℃高温条件下，DNA分子双螺旋解开，形成单链，此时氢键断裂，B项正确；体外模拟DNA的复制依据了DNA的热变性原理，该过程DNA分子不是边解旋边复制，C项错误；DNA复制需要遵循碱基互补配对原则，D项正确。\n1．PCR一般要经过三十次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将()A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸D．无须与引物结合，在酶的作用下从头合成子链变式训练B\n解析：当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5′端，与它互补的子链从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸。\n知识点1．目的(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。2．地位：基因工程的核心步骤。基因表达载体的构建\n3．基因表达载体的组成4．过程\n知识贴士启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，与终止子一样都位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止。(2)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。\n下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是()A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B．基因表达载体的构建并不一定相同C．图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因典例2典例剖析C\n解析：由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建也会有所差别，不可能是千篇一律的；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。\n2．(不定项)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法正确的是()变式训练A．卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来B．基因表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC．切割目的基因需要PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶D．除图示组成外，基因表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构ACD\n解析：卡那霉素抗性基因是标记基因，便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，A正确；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，需要在目的基因的两侧有酶切位点，而不能选择酶切位点在目的基因内部的限制酶，SmaⅠ的识别序列位于目的基因上，因此要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅡ，B错误、C正确；基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，D正确。\n知识点1．导入的方法目的基因导入受体细胞受体细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达简便、经济，我国科学家独创\n受体细胞类型方法说明特点动物细胞显微注射法目的基因片段受精卵的核内→将受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使受精卵发育成转基因动物将目的基因导入动物细胞的最有效的方法微生物细胞Ca2＋处理法(感受态细胞法)Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程简便、经济、有效\n2．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。\n知识贴士在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。\n下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是()A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞典例3典例剖析A\n解析：原核生物的细胞中没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，故生产的蛋白质可能没有生物活性；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术；植物病毒只侵染植物细胞。\n3．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是()A．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与变式训练A\n解析：⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A项正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到棉花细胞的染色体上，B项错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C项错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D项错误。\n知识点1．目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定\n2．不同分子检测原理的异同(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。(2)进行翻译水平的检测，通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原，制备相应抗体，检测转基因生物的蛋白质，利用抗原与抗体特异性结合的原理。(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。\n知识贴士基因工程操作过程中碱基互补配对现象基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。\n目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()①检测受体细胞中是否有目的基因②检测受体细胞中是否有致病基因③检测目的基因是否转录出了mRNA④检测目的基因是否翻译成蛋白质A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④典例4C典例剖析\n解析：对转基因中目的基因的分子水平的检测包括三个方面：①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了相应的mRNA，方法也是使用基因探针与之杂交；③检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，常用的方法是抗原—抗体杂交。\n4．绿叶海天牛(简称甲)吸食滨海无隔藻(简称乙)后，身体就逐渐变绿，这些“夺来”的叶绿体能够在甲体内长期稳定存在，有科学家推测其原因是在甲的染色体DNA上可能存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因。为证实上述推测，以这种变绿的甲为材料进行实验，方法和结果最能支持上述推测的是()变式训练\nA．提取甲的全部DNA，通过PCR技术能克隆出乙的编码叶绿体蛋白的核基因B．通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNAC．给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性D．用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA杂交，结果显示出杂交带答案：D\n解析：通过PCR技术从甲体内的DNA中克隆出属于乙的编码叶绿体蛋白的核基因，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，A项错误；通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNA，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因且发生了转录，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，B项错误；给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性，这只能说明甲进行了光合作用，其中含有叶绿体，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，C项错误；用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA杂交，结果显示出杂交带，这说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，D项正确。\n知识点1．原理(1)PCR利用DNA的热变性原理，通过调整温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。(2)DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团带上正电荷和负电荷。在电场的作用下，这些带电分子向着与它所带电荷相反的电极移动。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。DNA片段的扩增及电泳鉴定\n2．材料与用具(1)PCR仪一台能够自动调控温度的仪器。(2)微量离心管进行PCR反应的场所，一种薄壁塑料管，总容积为0.2mL或0.5mL。\n(3)微量移液器、一次性吸液枪头用于定量转移PCR反应体系的配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。(4)电泳装置(包括电泳仪、电泳槽)用于鉴定PCR的产物。(5)材料试剂4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。\n3．方法步骤(1)PCR扩增①准备：按照PCR反应体系的配方或PCR试剂盒的说明书，将所需的试剂摆放在实验桌上。②移液：用微量移液器按照PCR反应体系的配方往微量离心管里面加入各种试剂。③混合：盖严微量离心管的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：离心管的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。\n④离心a．过程：将微量离心管放入离心机里，离心约10s。b．目的：使挂在管壁上的液体全部甩下。⑤反应循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min注意：预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。\n(2)鉴定PCR产物——琼脂糖凝胶电泳法①配制琼脂糖溶液：用电泳缓冲液配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。\n②制备琼脂糖凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入适合大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。见下图：\n③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。④加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。⑤电泳：接通电源，进行电泳，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。⑥取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。\n用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如下图所示。据此作出的分析，不合理的是()A．PCR产物的分子大小为250～500bpB．3号样品为不含目的基因的载体DNAC．9号样品对应植株不是所需的转基因植株D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰典例5B典例剖析\n解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500bp，A项正确。3号PCR结果包含250～500bp片段，应包含目的基因，B项错误。9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C项正确。10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D项正确。\n5．对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标本与探针核酸的碱基异同。下图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，哪份标本最有可能被确诊为禽流感？()A．甲B．乙C．丙D．丁变式训练C\n解析：据图分析，图中P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，其中丙的电泳位置与P最接近，因此最有可能被确诊为禽流感。\n指点迷津•拨云见日\n一、PCR技术1．通过PCR技术获得目的基因的过程\n1．一般情况下，DNA模板链较长，需要PCR扩增的基因只是DNA模板链的一段。2．第一轮循环，两引物与模板链互补，DNA分子模板链最长，新合成的DNA单链(含有引物的链)较短。3．第二轮循环，以含有引物的母链为模板合成的DNA分子，会出现含有两个引物的DNA，其中新合成的单链b会比母链a更短，其实b就是我们所需扩增的目的基因的长度，只是b为单链。4．第三轮循环，以b为模板合成的DNA片段就是目的基因片段的长度。\n5．结果分析(1)两条单链等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现(甲、乙)。随循环次数的增加，目的基因含量会不断增加。(2)通过以上分析我们可知，PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，还会存在四种类型的DNA分子(这四种类型同第二轮循环产生的4个DNA分子)。(3)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA(目的基因)从第三轮循环开始出现，随着循环次数的增多，呈指数扩增。\n请回答以下基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。典例6典例剖析\n①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为____________。②在第____轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。15/16三\n(2)设计引物是PCR技术的关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。①第1组：__________________________________________；②第2组：________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效\n(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________________________________________________________________。DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上\n解析：(1)①由图可知，以原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第四轮循环共产生16个DNA分子，其中含有引物A的分子是15个，占15/16。②第一、二循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点，前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链。(2)引物是单链DNA时才能与DNA结合，而单链DNA的碱基互补配对部分容易形成双链结构而失去其功能。从图示可以看出，第1组引物Ⅰ和引物Ⅱ局部碱基互补配对，易形成双链结构而失效。第2组引物相互间不能发生碱基互补配对，但引物Ⅱ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，而不能直接将两个脱氧核苷酸连在一起。\n二、启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别项目启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束\n下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是()A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用典例6典例剖析C\n解析：由于人肝细胞中胰岛素基因不能表达，所以无法利用人肝细胞mRNA反转录获得胰岛素基因，A项错误；表达载体的复制启动于复制原点，但胰岛素基因的表达则开始于启动子，B项错误；抗生素抗性基因是标记基因，作用是检测受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有胰岛素基因的受体细胞筛选出来，C项正确；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，是转录的起点，而终止密码子位于mRNA上，在翻译中起作用，D项错误。\n解疑答惑从社会中来⇨P76提示：转基因抗虫棉抗虫的机制是抗虫基因(Bt基因)来源于苏云金杆菌，Bt基因表达的蛋白质具有杀虫活性。当害虫食用转基因抗虫棉花的时候，同时摄入Bt基因产生的抗虫蛋白，当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。培育转基因抗虫棉的步骤有目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。\n旁栏思考1⇨P79提示：用PCR不能直接扩增mRNA，DNA聚合酶识别的是双链DNA，mRNA为单链结构。应首先逆转录获得cDNA才能进行PCR。旁栏思考2⇨P80提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。\n到社会中去⇨P831．提示：这是一个开放性的问题，需要查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年获得的证据是不一样的。要注意搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。2．提示：科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。\n(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。\n(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。\n练习与应用⇨P83一、概念检测1．(1)√(2)×提示：构建质粒要用到限制酶(用来在特定位点进行切割)和DNA连接酶(用来连接目的基因和载体)，不需要核酸酶。(3)×提示：目的基因成功导入受体细胞后不一定会表达，还需要进行检测和鉴定。2．D提示：延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种脱氧核苷酸。\n二、拓展应用1．提示：可能在自交繁殖过程中存在转基因的沉默或丢失现象。2．提示：(1)psy和crlⅠ基因、pmi基因将目的基因送入受体细胞。(2)不能，限制酶会将目的基因切断，破坏目的基因。\n(3)维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β－胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β－胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β－胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。\n探究·实践⇨P84结果分析与评价1．提示：观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。2．提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。\n训练巩固•课堂达标\n1．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因在导入受体细胞后完成表达的是()A．棉花细胞中检测到载体上的标记基因B．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因C．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNAD．酵母菌细胞中提取到人的干扰素解析：A、B两项只说明目的基因已导入受体细胞中，C项说明目的基因在受体细胞中转录出了mRNA。D项含有人的干扰素基因的酵母菌合成了人的干扰素，说明目的基因完成表达。D\n2．转基因抗虫植物中的Bt抗虫蛋白基因()A．来源于苏云金杆菌B．指导合成降低害虫蛋白酶活性的物质C．指导合成降低害虫淀粉酶活性的物质D．在植物细胞中指导合成植物凝集素解析：转基因抗虫植物中的Bt抗虫蛋白基因来源于苏云金杆菌，Bt抗虫蛋白进入害虫肠道后，能够降解成多肽，多肽结合在害虫肠上皮细胞的特异性受体上，会导致细胞膜穿孔，细胞肿胀裂解，最后造成害虫死亡。A\n3．山东曲阜某蔬菜基地栽种了一种抗虫大白菜，这是运用转基因技术把苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因转移到大白菜细胞中培育而成的，在这一过程中要进行基因表达载体的构建。根据所学知识推断，作为基因表达载体应具备的结构有()A．目的基因、启动子B．起始密码子、目的基因、终止密码子、标记基因C．目的基因、启动子、终止子D．启动子、目的基因、终止子、标记基因D\n解析：根据题意分析，苏云金杆菌的抗虫基因是目的基因；将目的基因插入载体质粒后，要想目的基因得到成功表达，还需要在目的基因上游插入启动子，在目的基因下游插入终止子；此外为了便于筛选出含有目的基因的受体细胞，还要求载体上有标记基因。因此，作为基因表达载体应具备的结构有目的基因、启动子、终止子、标记基因等，故选D。\n4．(不定项)PCR是一种在生物体外迅速扩增DNA片段的技术，被广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、基因克隆等方面。下列关于PCR反应的叙述，错误的是()A．PCR反应需要在一定的缓冲液中进行B．PCR反应需要的能量由ATP直接提供C．用新形成的DNA链作模板再次复制时，不需要引物D．PCR反应中每次循环均可分为变性、复性和延伸三步BC\n解析：PCR反应需要在一定的缓冲液中进行，A项正确；PCR反应不需要ATP直接提供能量，B项错误；用新形成的DNA链作模板再次复制时，需要引物，C项错误；PCR反应中每次循环均可分为变性、复性和延伸三步，可以快速扩增DNA，D项正确。\n5．有关科学家将苏云金芽孢杆菌的Bt抗虫蛋白基因转入到普通棉花细胞内，并成功地实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如下图所示。\n(1)基因工程的操作程序主要包括四个步骤，其核心步骤是____________________。(2)获取Bt抗虫蛋白基因的方法一般有_______________________________________等。(3)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用了T－DNA_____________________________________________________的特点。(4)将目的基因导入受体细胞的方法很多，在本题中涉及的方法是______________。基因表达载体的构建从基因文库中提取、PCR扩增、人工合成可转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上农杆菌转化法\n解析：(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，其核心步骤是基因表达载体的构建。(2)Bt抗虫蛋白基因属于目的基因，获取目的基因的方法一般有：从基因文库中提取、利用PCR技术扩增、人工合成等。(3)农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体DNA分子上。在培育转基因植物时，利用Ti质粒上的T－DNA的这一特点，可将目的基因转移到受体细胞染色体DNA上。(4)由图可知，在该题中将目的基因导入受体细胞，采用的方法是农杆菌转化法。